Original: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/microscopy.html

 

 

 

 

Світловий мікроскоп має таку назву, тому що він використовує видиме світло для виявлення дрібних предметів, мабуть, найвідоміший і добре використовували інструмент дослідження в області біології. Проте, багато студентів і викладачів не знають повного спектра можливостей, доступних в світлових мікроскопів. Так як вартість одного інструмента збільшується з його якістю і універсальністю, кращі інструменти, на жаль, недоступні для більшості академічних програм. Проте, навіть найдешевші “студентські” мікроскопи можуть забезпечити захоплюючий вид на природу і можуть дати студентам можливість виконувати деякі досить складні експерименти.

Новачок схильний думати, що проблема перегляду невеликих об’єктів полягає в отриманні достатнього збільшення. Насправді, коли справа доходить до дивлячись на живі істоти найбільші проблеми, в порядку:

• отримання достатньої контрастності
• знаходження в фокальній площині
• отримання хорошого дозволу
• розпізнавання предмета, коли його видно
  

Найменші об’єкти, які вважаються жити є бактерії. Найменші бактерії можна спостерігати і форма клітин визнана в просте 100-кратному збільшенні. Вони невидимі в яскравих польових мікроскопів, хоча. Ці сторінки будуть описані типи оптики, які використовуються для отримання контрасту, пропозиції для пошуку зразків і фокусування на них, а також поради щодо використання вимірювальних приладів зі світловим мікроскопом.

Типи світлових мікроскопів

Яскраве поле мікроскопа є найвідомішим студентам і, швидше за все, можна знайти в класі. Краще обладнані класи та лабораторії можуть мати темне поле і/або фазовим контрастом оптики. Диференціальна інтерференційного контрасту, Номарскі, Хоффман контраст модуляції і варіації виробляють значну глибину роздільної здатності і тривимірного ефекту. Флуоресцентні та конфокальної мікроскопи спеціалізовані інструменти, використовувані для проведення досліджень, клінічних і промислових застосувань.

Крім складного мікроскопа, більш простий інструмент для низького використання збільшення також можуть бути знайдені в лабораторії. Стереомікроскоп, мікроскоп або розсічення зазвичай має бінокулярний окуляр трубки, велике робоче відстань і діапазон збільшень зазвичай від 5х до 35 або 40х. Деякі інструменти лінзи харчування для більш високих збільшень, але немає ніяких поліпшень у резолюції. Таке “помилкове збільшення” рідко вартує витрат.

Світлопольна мікроскопія

При звичайному яскравому поле мікроскопа, світло від джерела розпеченого спрямований в бік об’єктива під сценою називається конденсатор, через зразок, через лінзу об’єктива, і в око через другу лупу, окуляр або окуляр. Ми бачимо об’єкти в шляху проходження світла через природної пігментації або плями поглинають світло по-різному, або тому, що вони досить товстим, щоб поглинути значну кількість світла, не дивлячись на безбарвне. Парамецій повинен з’явитися досить добре в світлому полі мікроскопа, хоча це не буде легко побачити вії або більшість органел. Живі бактерії не будуть відображатися на всіх, якщо глядач не потрапляє в фокальній площині завдяки щасливому випадку і спотворює зображення за допомогою максимального контрасту.

Хороша якість мікроскоп має вбудований освітлювач, регульований конденсатор з апертурною діафрагмою (контраст), контроль стадії механічної і бінокулярного окуляр трубки. Конденсатор використовується для фокусування світла на зразок через отвір в стадії. Після проходження через зразок, світло відображається на-віч з видимим полем, яке набагато більше, ніж площа освітленої. Збільшення цього зображення просто лінза об’єктива збільшення (зазвичай вибитий на корпусі об’єктива) раз очне збільшення.

Студенти, як правило, знають про використання грубого й точного фокусування ручки, які використовуються для підвищення різкості зображення зразка. Вони часто не знають про коригування в конденсаторі, який може вплинути на дозвіл і контрастність. Деякі конденсатори закріплені в положенні, інші фокусуються, так що якість світла можна регулювати. Як правило, краще становище для фокусованої конденсатора якомога ближче до сцени, наскільки це можливо. Яскраве поле конденсатора зазвичай містить апертурними діафрагми, пристрій, який регулює діаметр світлового пучка, що настає вгору через конденсатор, так що, коли діафрагма зупиняється вниз (майже закрита) світло йде прямо вгору через центр лінзи конденсатора і контрастність висока. Коли діафрагма широко відкрита зображення яскравіше і контраст низький.

Недолік того, щоб покладатися виключно на апертурними діафрагми для контрасту є те, що за межами оптимальної точки більше контрасту ви робите тим більше ви спотворюють зображення. З маленьким, чистим, пофарбованого пігментом зразка, ви, як правило, мимо оптимального контрасту, коли ви починаєте бачити зображення.

Використання світлопольного мікроскопа

По-перше, подумайте про те, що ви хочете зробити з мікроскопом. Що таке максимальне збільшення вам потрібно? Ви дивіться на фарбували зразок? Наскільки контраст/дозвіл вам потрібно? Потім приступити до налаштування для перегляду.

Встановіть зразок на столику

Ковзання кришка повинна бути вище, якщо такий є. Висока збільшення об’єктивів не може зосередитися через товстий скло; вони повинні бути наближені до зразка, тому покривні настільки тонкі. Ступінь може бути оснащений простими зажимами (і менш дорогими мікроскопами), або з деяким типом власника слайдів. Слайдів може знадобитися ручне позиціонування, або може бути механічний етап (кращий варіант), що забезпечує точне позиціонування, не торкаючись слайда.

Оптимізуйте освітлення

Джерело світла повинен мати широкий динамічний діапазон, щоб забезпечити високу інтенсивність освітлення при високих збільшеннях і більш низької інтенсивності, так що користувач може переглядати комфортно при низьких збільшеннях. Краще мікроскопів мають вбудований освітлювач, а також кращі мікроскопи мають контроль над інтенсивністю світла і форми світлового променя. Якщо ваш мікроскоп необхідний зовнішній джерело світла, переконайтеся, що світло спрямоване до центру конденсатора. Налаштуйте освітлення так, щоб поле яскраво, не завдаючи шкоди очам.

Налаштуйте конденсатор

Для регулювання і вирівнювання мікроскопа, почніть з читання інструкції. Якщо ніяке керівництво не є, спробуйте використовувати ці принципи. Якщо конденсатор фокусируемое, помістіть його з об’єктивом якомога ближче до отвору в сцені, як ви можете отримати його. Якщо конденсатор має варіанти на вибір, встановіть його в світлому полі. Почніть з діафрагма зафіксується (високий контраст). Ви повинні побачити світло, який з’являється через зміну яскравості зразка при переміщенні важеля діафрагма.

Подумайте про те, що шукаєте

Набагато важче знайти щось, коли у вас немає ніяких очікувань щодо його вигляду. Наскільки воно велике? Чи буде вона рухається? Забарвлена вона або покрита іржею, і якщо це так, що його колір? Де ви очікували знайти це на слайді? Наприклад, студенти, як правило, мають багато проблем з пошуком забарвлених бактерій, тому що неозброєним оком і при низьких збільшеннях матеріал виглядає як бруд. Це допомагає знати, що, як мазки сухий вниз, вони зазвичай залишають кільця таким чином, щоб край мазка зазвичай має густу концентрацію клітин.

Сфокусуйте, розташуйте та відцентруйте зразок

Почнемо з найменшому збільшенні об’єктива, щоб в домашніх умовах на зразку і/або частини зразка, який ви хочете дослідити. Це досить легко знайти і зосередитися на ділянках тканин, особливо якщо вони фіксували і фарбували, як і в більшості підготовлених слайдів. Однак це може бути дуже важко знайти живі, дрібні зразки, такі як бактерії або непігментовані найпростішими. Суспензію клітин дріжджів робить хорошу практику зразок для виявлення складних об’єктів.

• Використовуйте режим темного поля (якщо такі є), щоб знайти незабарвлені зразки. Якщо немає, то почніть з високою контрастністю (діафрагма закрита).
• Почніть з зразком з фокуса так, що стадія та мета повинна бути наближені один до одного. Перша поверхню, щоб прийти в центр уваги, як ви приносите сцену і мета разом у верхній частині покривного скла. З мазків, кришка ковзання часто не використовується, тому перше, що ви бачите, сам мазок.
• Якщо у вас виникли проблеми, зосередити увагу на краю кришки ковзання або повітряної бульбашки, або щось, що ви можете легко розпізнати. Верхній край покривного скла входить в фокус, а потім в нижній частині, яка повинна бути в тій же площині, що і ваші зразка.
• Після того, як ви знайшли зразок, регулювати контрастність і інтенсивність підсвічування, і перемістити слайд навколо, поки ви не будете мати хорошу область для перегляду.

Налаштуйте відстань окуляра, фокус

За допомогою одного окуляра, немає нічого спільного з окуляром, за винятком, щоб тримати його в чистоті. За допомогою бінокулярного мікроскопа (переважно) вам потрібно налаштувати поділ окуляр так само, як ви робите пару біноклів. Бінокулярний зір набагато більш чутливий до світла і детально, ніж монокулярного зору, так що якщо у вас є бінокулярний мікроскоп, скористатися цим.

Один або обидва з окулярів може бути телескопічним окуляр, тобто, ви можете сфокусувати його. Так як дуже небагато людей мають очі, які ідеально поєднуються, більшість з нас потрібно зосередитися один окуляр, щоб відповідати іншим зображенням. Подивіться з відповідним оком в нерухому окуляра і фокус за допомогою ручки мікроскопа фокуса. Далі, подивіться в регульований окуляр (з іншим оком, звичайно), і відрегулюйте окуляр, а не мікроскоп.

Виберіть об’єктив для перегляду

Найнижча лінза потужність зазвичай 3,5 або 4x, і використовується в основному для початкового знаходження зразків. Іноді ми називаємо це сканування лінзи з цієї причини. Найбільш часто використовується лінза об’єктива з 10-кратним об’єктивом, який дає кінцеве збільшення 100х з 10-кратним окуляром. Для дуже маленьких протистов і деталей в підготовлених слайдів, таких як клітинних органел або митотических фігур, вам буде потрібно більше збільшення. Типові лінзи високого збільшення, 40x і 97x або 100x. Останні два збільшеннях використовуються виключно з маслом для того, щоб поліпшити якість зображення.

Піднятися в збільшенні кроками. Кожен раз, коли ви йдете до більш високої мети потужності, переорієнтувати і повторного центру зразка. Більш високе збільшення лінзи повинні бути фізично ближче до самого зразка, що створює ризик заклинювання мети в зразок. Будьте дуже обережні при фокусуванні. До речі, хороші набори якості лінз є парфокальное, тобто, коли ви вмикаєте збільшеннях зразок залишається в фокусі або близько до цілеспрямованим.

Більше не завжди краще. Всі зразки мають три виміри, і якщо зразок не дуже тонкий, ви будете не в змозі зосередитися з високою метою збільшення. Чим вище збільшення, тим важче “погоня” рухається зразка.

Налаштуйте підсвічування для обраного об’єктива

Видиме поле окуляра постійна і не залежить від збільшення використовуваного. З цього випливає, що, коли ви піднімаєте збільшення площі освітлюваних зразка ви бачите менше. Так як ви дивитеся на меншу площу, тим менше світла досягає очей, а зображення темніє. З метою низької потужності ви, можливо, доведеться скоротити інтенсивність освітлення. При високій потужності вам потрібен весь світ, ви можете отримати, особливо з менш дорогими мікроскопами.

Коли використовується світлопольна мікроскопія

Світле поле мікроскопія найкраще підходить для перегляду забарвлених або природно пігментованих зразки, такі як пофарбованими, підготовлених слайдів зрізів тканин або живих фотосинтезирующих організмів. Це марно для живих зразків бактерій, і поступається по нефотосінтетіческіх найпростішими або багатоклітинні або нефарбованих суспензій клітин або зрізів тканин. От не так повний перелік зразків, які можуть спостерігатися за допомогою яскраво-польовий мікроскопії та відповідних збільшеннях (підкреслені кращі кінцеві збільшеннях).

• Підготовлені слайди, тонований – бактерії (1000x), ділянки товстої тканини (100x, 400x), тонкі зрізи з конденсованими хромосомами або спеціально забарвленими органел (1000x), великих найпростішими або багатоклітинні (100x).
• Мазки, тонований – кров (400x, 1000x), негативні бактерії заплямовані (400x, 1000x).
• Живі препарати (вологі монтує, нефарбовані) – водойма (40x, 100x, 400x), живі Найпростіші або багатоклітинні (40x, 100x, 400x іноді), водорості та інші мікроскопічні рослинні матеріали (40x, 100x, 400x). Більш дрібні особини буде важко спостерігати без спотворень, особливо якщо у них немає пігментації.

Догляд за мікроскопом

• УСІ частини високоякісного мікроскопа надзвичайно дорогі, будьте обережні.
• Тримайте мікроскоп міцно на стенді, тільки. Ніколи не захопити його за допомогою утримувача окуляра, наприклад.
• Візьміться за вилку (не за кабель) при відключенні підсвічування.
• Так як цибулини коштують дорого, і мають обмежений термін служби, включити підсвічування, коли ви закінчите.
• Завжди переконайтеся, що сцена і лінзи чисті перед прибирання мікроскопа.
• НІКОЛИ не використовуйте паперовий рушник, Kimwipe, сорочку, або будь-який матеріал, крім хорошої тканини якості лінз або ватяним тампоном (повинно бути 100% натуральна бавовна), щоб очистити оптичну поверхню. Будь ніжним! Ви можете використовувати відповідний очищувач для об’єктивів або дистильовану воду, щоб допомогти видалити висушений матеріал. Органічні розчинники можуть розділяти або пошкодити елементи об’єктива або покриття.
• Накривайте прилад пилезахисним кожухом, коли він не використовується.
• Фокус установлюйте плавно; не намагайтеся прискорити через процес фокусування або змусити що-небудь. Наприклад, якщо ви зіткнулися з підвищеною стійкістю при фокусуванні, то ви, ймовірно, досягли межі, і ви збираєтеся в неправильному напрямку.

Автор: Девід Р. Капретт ([email protected]), Університет Райс, 7 вересня 1995 року
Оновлено 10 серпня 2012 року